UNIVERSIDAD CATÓLICA LOS ÁNGELES DE CHIMBOTE FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA


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1 UNIVERSIDAD CATÓLICA LOS ÁNGELES DE CHIMBOTE FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA EFECTO ANTIMICÓTICO IN VITRO DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DEL ACEITE ESENCIAL DE LAS HOJAS DE Peperomia inaequalifolia CONGONA EN CULTIVO DE Candida albicans cepa ATCC TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO FARMACEÚTICO AUTORA: MARLENI EDUBINA REYES RODRÍGUEZ ASESOR: Mgtr. Q.F. CÉSAR ALFREDO LEAL VERA TRUJILLO PERÚ 2018

2 JURADO EVALUADOR DE TESIS Dr. Q.F. Jorge Luis Díaz Ortega Presidente Mgtr. Q.F. Nilda María Arteaga Revilla Miembro Mgtr. Q.F. Luisa Olivia Amaya Lau Miembro Mgtr. Q.F. César Alfredo Leal Vera Docente Tutor Investigador

3 AGRADECIMIENTO A Dios por prestarme la vida, por darme sabiduría e inteligencia, por sus cuidados y permitir que alcance uno de los objetivos más grandes de mi vida. A mis profesores de la Universidad ULADECH quienes me brindaron sus enseñanzas en el transcurso de mi carrera. A mi madre: Santos Felicita y a mi tío Enrique por su apoyo incondicional, por sus consejos, sus valores y por la motivación constante, porque creyeron en mi dándome ejemplos de superación, sacrificio y entrega en cada cosa que realizaba; gracias a ustedes hoy puedo alcanzar una de mis metas, sus consejos y su fortaleza hicieron que llegue hasta el final. iii

4 DEDICATORIA A mi madre: Santos Felicita Rodríguez por su apoyo permanente e incondicional, hasta lograr que sea una buena profesional, por su afecto, comprensión y por ser el motor de mi vida. A mi sobrino: Luis Ángel por ser mi fortaleza en cada debilidad. A la memoria de mi hermano, que con sus consejos y dedicación logró fortalecer mi espíritu para alcanzar mi meta. A mis tíos: Enrique Ramos y Rosalia Ramos por su apoyo incondicional y su constante motivación, por sus enseñanzas que me formaron para ser una mujer de bien. A un gran amigo especial: Lennin Loyaga por su apoyo y compañía durante el desarrollo de toda mi tesis. iv

5 RESUMEN El presente trabajo de investigación, de diseño experimental, se desarrolló con el fin de comparar el efecto antimicótico del aceite esencial de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona, procedente de la Provincia de Otuzco, Departamento de la Libertad, en concentraciones de 5%, 10%, 20% y 100% en cultivo de Candida albicans ATCC El aceite esencial de las hojas Peperomia inaequalifolia congona, se extrajo por el método de hidrodestilación, del cual se obtuvo 5ml de aceite esencial de las hojas de la planta fresca, y para la preparación de las diferentes concentraciones se utilizó diluyente Dimetilsulfóxido (DMSO) el cual se utilizó como control negativo, los diámetros de halo de inhibición para las concentraciones de 5%, 10%, 20% y 100% fueron 1.82 mm, 2.89 mm, 6.3 mm y mm respectivamente no difiriendo significativamente, sin embargo se observa que a la concentración del aceite esencial al 100% el halo de inhibición alcanza un diámetro de halo de inhibición mm no difiriendo del control positivo (p >0.05), a través de la prueba Kruskal Wallis y Mann Whitney. Se concluye que el microorganismo Candida albicans es sensible al menos a una de las cuatro concentraciones que es la concentración del 100% del aceite esencial de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona PALABRAS CLAVES: Peperomia inaequalifolia, aceite esencial, efecto antimicótico. v

6 ABSTRATC The present research work, experimental design, was developed in order to compare the antifungal effect of the essential oil of the leaves of Peperomia inaequalifolia "congona", from the Province of Otuzco, Department of Liberty, in concentrations of 5%, 10%, 20% and 100% on culture of Candida albicans ATCC The essential oil of the leaves Peperomia inaequalifolia "congona" was extracted by the hydrodistillation method, from which 5ml of essential oil was obtained from the leaves of the fresh plant, and for the preparation of the different concentrations diluent Dimethylsulfoxide (DMSO) was used which was used as a negative control, the inhibition halo diameters for the concentrations of 5%, 10%, 20% and 100% were 1.82 mm, 2.89 mm, 6.3 mm and mm respectively, not differing significantly, however it is observed that at the concentration of the 100% essential oil the inhibition halo reaches an inhibition halo diameter of mm, not differing from the positive control (p> 0.05), through the Kruskal - Wallis and Mann Whitney test. It is concluded that the microorganism Candida albicans is sensitive to at least one of the four concentrations that is the concentration of 100% of the essential oil of the leaves of Peperomia inaequalifolia "congona" KEY WORDS: Peperomia inaequalifolia, essential oil, antifungal effect. vi

7 CONTENIDO AGRADECIMIENTO iii DEDICATORIA......iv RESUMEN...v ABSTRACT.....vi I. INTRODUCCIÓN...1 II. REVISIÓN LITERARIA Antecedentes Bases teóricas...8 III. HIPÓTESIS IV. METODOLOGÍA Diseño de la investigación Población y muestra Definición y Operacionalización de las variables Técnicas e instrumentos Plan de procesamiento y análisis Matriz de consistencia Principios éticos V. RESULTADOS Resultados Análisis de resultados VI. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Conclusiones Recomendaciones REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS... 38

8 CONTENIDO DE TABLAS Tabla N 1. Diámetro del halo de inhibición como efecto antimicótico in vitro del aceite esencial de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona en cultivo de Candida albicans cepa ATCC10231, según concentración...27 Tabla N 2. Comparación del efecto antimicótico in vitro en diferentes concentraiones del aceite esencial de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona en cultivo de Candida albicans cepa ATCC

9 CONTENIDO DE FIGURAS Figura N 1: Planta de congona Figura N 2: Ciudad de Otuzco Figura N 3: Obtención del material vegetal Peperomia inaequalifolia congona 39 Figura N 4: Separación de las hojas de los tallo de la planta Peperomia inaequalifolia congona Figura N 5: Hojas de la planta de Peperomia inaequalifolia congona Figura N 6: Pesar las hojas de Peperomia inaequalifolia congona Figura N 7: Preparación del equipo Figura N 8: Obtención del aceite esencial de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona.39 Figura N 9: Aceite esencial 5ml de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona...40 Figura N 10: Siembra del microorganismo en agar sabouraud.. 40 Figura N 11: Aplicación de diferentes concentraciones de aceite esencial en Candida albicas cepa ATCC Figura N 12: Lectura de las placas..40

10 I. INTRODUCCIÓN Como sustento para su supervivencia a lo largo de la historia el hombre aprovechó los recursos naturales que la naturaleza le brindó; la incidencia de los productos de origen vegetal ha variado con el pasar de los tiempos, de acuerdo con los avances del conocimiento científico. En nuestro país existe una riqueza y diversidad de las plantas nativas, que por sus bondades terapéuticas son usadas de forma empírica. Hoy en día los aceites esenciales que son productos naturales de gran valor e importancia económica son utilizados como materias primas en áreas tales como: perfumería, aromaterapia, fitoterapia (1-3). Los problemas de salud y la difícil consecución de medicamentos comerciales, han llevado nuevamente a la búsqueda de la medicina tradicional a través del uso y manejo de las plantas. Las diferentes plantas medicinales tienen una contribución importante en el sistema de salud de muchas comunidades locales, ya que son usadas de manera frecuente por la mayoría de la población rural, estas desempeñan un papel dominante en el desarrollo y en la investigación experimental (3). Las plantas constituyen un recurso valioso en los sistemas de salud de los países en desarrollo y tienen importantes aplicaciones en la medicina moderna, porque se utiliza una gran variedad de plantas para desarrollar medicamentos altamente efectivos contra diversas enfermedades partiendo del conocimiento ancestral y la etnomedicina; que está siendo la fuente de información preliminar para la investigación Fitoquímica, la identificación de principios activos y estudios de actividad biológica que, en algunos 1

11 casos, han permitido el desarrollo de nuevas drogas. El progreso de la industria farmacéutica y la producción de drogas sintéticas, han limitado en alguna medida de utilización de la fitoterapia (4). La Organización Mundial de la Salud (OMS), ha estimado que más del 80% de la población mundial utiliza, rutinariamente, la medicina tradicional para satisfacer sus necesidades de atención primaria de salud y que gran parte de los tratamientos tradicionales implica el uso de extractos de plantas o sus principios activos. La Organización Mundial de la Salud (OMS) hizo un llamado para que los países incrementen sus esfuerzos para controlar la resistencia antimicrobiana; promoviendo el uso racional de los mismos; desarrollando sistemas de comunicación para recabar y compartir datos sobre resistencia en patógenos específicos promoviendo la investigación y desarrollo de nuevos agentes antibacterianos (4,5). La medicina tradicional a base de plantas medicinales es un campo interesante y se convierte en una alternativa terapéutica para patologías específicas por su bajo costo y fácil acceso a la población de bajos recursos económicos. Desde la antigüedad las plantas son consideradas un alto potencial terapéutico para el tratamiento de diversas enfermedades infecciosas (5). En los últimos años se presenta un incremento en la incidencia de enfermedades fúngicas en los seres humanos; debido al aumento considerable de pacientes inmunocomprometidos, quimioterapia, nutrición parenteral, cirugía de trasplante y el uso de agentes antimicrobianos de amplio espectro. Los fármacos disponibles 2

12 actualmente, tienen una toxicidad importante, producen recurrencia o causan resistencia, razón por la cual se está procurando descubrir nuevos agentes anti fúngicos más potentes pero sobre todo seguros (5). Los compuestos derivados de plantas son de interés en este contexto porque ellos comprenden alternativas más seguras y eficaces que los agentes antimicrobianos producidos sintéticamente, lo cual motiva a que estos compuestos naturales sirvan como base para el desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos que sean más eficaces que los sintéticos. Debido a que en diversas investigaciones a nivel mundial se han establecido que muchas plantas aromáticas poseen actividad antibacteriana, antimicótica, antiparasitaria, antiviral e inclusive con efectos insecticidas (5). La importancia de la fitoterapia pone de manifiesto la necesidad de investigar sobre las propiedades farmacológicas de las plantas que no han sido determinadas perfectamente en nuestro medio como las plantas del género de Peperomia inaequalifolia son de uso frecuente como medicamentos en la sierra, en casi toda la costa del Perú y parte de la Selva, es necesario estudiar científicamente sus efectos con el fin de permitir su uso racional. A pesar de los últimos avances terapéuticos, la candidiasis vulvovaginal continúa siendo un problema en el mundo y afectando a todos los sustratos sociales. Aun no se comprende en su totalidad los mecanismos defensivos vaginales a pesar que se han identificado numerosos factores de riesgo, falta dilucidar algunos mecanismos patógenos de esta infección. La candidiasis vulvovaginal es una patología no notificada, que se da por muchos errores en el diagnóstico y por estudios poco representativos, un 70 a 75% 3

13 afecta más a mujeres en edad fértil, se estima que de 5 a 8% de las mujeres desarrolla un cuadro más grave y en promedio de 20% de las mujeres sanas asintomáticas esta colonizada por Candida (6). Según la Organización de Salud la candidiasis es una infección de transmisión sexual que su malestar clínico se manifiesta al interferir con las relaciones sexuales afectivas, comprometiendo el rendimiento laboral, esto se debe a que la infección es sumamente común (7). La candidiasis obedece al desarrollo anormal de especies de Candida en la mucosa tracto genital femenino; las manifestaciones clínicas que presenta esta patología son prurito intenso, leucorrea, edema y eritema vaginal. En el país esta patología de Candidiasis vaginal es considerada la segunda causa más frecuente del flujo vaginal en la población femenina (7, 8). Las plantas medicinales y sus extractos son ampliamente utilizados por los practicantes de la medicina tradicional para curar diversas enfermedades. La creciente aceptación de la medicina tradicional como una forma alternativa de atención de la salud y la búsqueda de nuevos agentes antifúngicos a partir de plantas medicinales, se ha vuelto muy importante (9) Es por ello que este estudio de investigación quiere demostrar a la población la prevención o sanidad de dicha patología haciendo el uso de la planta medicinal, debido a que existen estudios que los principios activos del aceite de las hojas de la Peperomia inaequalifolia congona tiene efecto antimicótico. Respondiendo a la siguiente 4

14 pregunta: Tendrán el mismo efecto antimicótico in vitro las concentraciones del aceite esencial de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona, en el cultivo cepas de Candida albicans ATCC 10231? La candidiasis es una enfermedad que hoy en día está causando ciertos malestares mayormente en la población, es por ello la importancia de la investigación de este estudio que parte en buscar un tratamiento para dicho malestar, utilizando el aceite esencial de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona comprobando su efecto en Candida albicans cepa ATCC in vitro, con el fin de que sirva como beneficio a la población. Esta investigación se basa en buscar productos alternativos como son las plantas medicinales, y en este caso utilizando el aceite esencial de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona en cepas de Candida albicans cepa ATCC puedan tener mejor o igual efecto antimicótico que los medicamentos ya conocidos, de esta manera se pueda utilizar en el futuro en preparaciones farmacéuticas para la prevención o como tratamiento para la Candida albicans. 5

15 OBJETIVOS Objetivo general. 1. Determinar el diámetro de los halos de inhibición como efecto antimicótico in vitro del aceite esencial de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona en cultivo de Candida albicans cepa ATCC 10231según concentraciones. Objetivos específicos. 2. Comparar el efecto antimicótico en diferentes concentraciones del aceite esencial de las hojas Peperomia inaequalifolia congona en el cultivo de Candida albicans cepa ATCC

16 II. REVISIÓN LITERARIA 2.1. ANTECEDENTES a) Nivel internacional. Carvajal et al (10). en la Facultad de ingeniería de Biotecnología de la Universidad Politécnica Salesiana Sede Quito, realizaron un estudio con el objetivo de comprobar o evaluar la caracterización Fitoquímica, actividad antimicrobiana y el efecto antimicótica del aceite de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona, se extrajo el aceite esencial de la misma por el método de hidrodestilación con trampa de cleverger modificada, cuyo rendimiento con planta fresca fue del 0.116%. En la composición química del aceite esencial de congona por medio de cromatografía de gases acoplada a masas, lograron demostrar que el aceite de congona posee un total de 10 compuestos; los compuestos principales que pudieron ser identificados por su mayor porcentaje son: Miristicina (65.197%), Elimicina (21.068%) y el tercer componente es el Bisabolol alpha (6.64%). Se estudió la actividad biológica del aceite esencial frente a cuatro bacterias y una levadura autóctonas, de DIRERLAB, Laboratorio de Microbiología de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador resultando que las bacterias Gram positivas: Staphylococcus epidermis y Staphylococcus aureus y la levadura Cándida albicans mostraron sensibilidad, mientras que en las Gram negativas: Eschecichia coli y Samonella sp. La sensibilidad fue nula. 7

17 Coronel et al (11). en la facultad de Biotecnología de los recursos naturales de la Universidad Politécnica Salesiana Sede Quito, realizaron un estudio de las propiedades físico y composición química de los aceites esenciales de las hojas de Peperomia inaequalifolia Ruiz & Pav. Y Piper pubinervulum C. DC. Y del rizoma de Renealmia thyrosoidea subsp. Thyrsoidea. Desarrollaron una serie de análisis para la identificación de la composición química de los aceites esenciales de Peperomia inaequalifolia a través de cromatografía de gases acoplado a espectrómetro de masas, cromatografía fina, encontraron presencia safrol (3.19%) y palmitato de isopropilo (2.54%), una molécula que confiere una alta densidad de aceite superior a la del agua, así como el alcaloide miristicina (0.19%), triazol (1.68%) BASES TEÓRICAS DE LA INVESTIGACIÓN a) Planta medicinal: Son aquellos vegetales que elaboran unos productos llamados principios activos, que son sustancias que ejercen una acción farmacológica, beneficiosa o perjudicial, sobre el organismo vivo (12). Fernando Muñoz señala que en uno o más de sus órganos contienen sustancias que pueden ser utilizadas con finalidad terapéutica su actividad primordial a veces específica, es servir como droga o medicamento que alivie la enfermedad o restablezca la salud perdida; que tienen a disminuir o neutralizar el desequilibrio orgánico que es la enfermedad (13). 8

18 Según Victoria y Morón señalan, estos están destinados a conocer el potencial terapéutico de sus estructuras, de los extractos de estas y a determinar las posibles reacciones tóxicas que puedan ocasionar (14). Usos: Las plantas medicinales constituyen un grupo vegetal de gran interés en cuanto a la industria farmacéutica, cosmética, perfumería y alimentaria; siendo una alternativa a los cultivos tradicionales (15). b) Aceites esenciales Son productos del metabolismo de las plantas y en su composición generalmente están presentes hidrocarburos y sesquiterpenicas, así como derivados oxigenados biogenéticamente derivados de ellos. Son la fuente de los olores de las flores, hojas, frutos, corteza y madera de muchas plantas aromáticas, generalmente localizadas en zonas templadas y cálidas como las áreas mediterráneas y tropicales (16). Los aceites esenciales son las fracciones líquidas volátiles, generalmente destilables por arrastre con vapor de agua, que contienen las sustancias responsables del aroma de las plantas y que son importantes en la industria cosmética (perfumes y aromatizantes), de alimentos (condimentos y saborizantes) y farmacéutica (saborizantes) (16). 9

19 Los aceites esenciales generalmente son mezclas complejas de hasta más de 100 componentes que pueden ser: compuestos alifáticos de bajo peso molecular (alcanos, alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres y ácidos), monoterpenos, sesquiterpenos y fenilpropanos. En su gran mayoría son de olor agradable, aunque existen algunos de olor relativamente desagradable como por ejemplo los del ajo y la cebolla, los cuales contienen compuestos azufrados (17). c) Descripción de la especie vegetal Peperomia inaequalifolia Congona Peperomia inaequalifolia Congona Taxonomía Nombre científico: Peperomia inaequlifolia Nombre vulgar: congona Reino: Plantae División: Fanerogama Magnoliopsida Orden: Piperales Familia: Piperaceae Género: Peperomia Especie: inaequalifolia (10,18). 10

20 Familia Piperaceae: La familia de las piperáceas tiene especies leñosas y herbáceas de las regiones tropicales con hojas alternas, raramente verticiladas, sus flores son hermafroditas y lampiñas, su inflorescencia en espiga dispuesta en el ápice de las ramas. El mayor uso de las Piperaceae se encuentran en la medicina popular gracias a las propiedades biológicas de los metabolitos secundarios acumulados como: las amidas piperidinicas, pirrolidinicas, aceites esenciales, pironas, lignanas, neolignanas y metabolitos de biosíntesis mixta (18). Características Es una planta herbácea suculenta que mide 50 cm de altura, tiene un tallo cilíndrico, nudoso y ramificado, sus hojas son de color verde brillante, redondas verticiladas, de mayor tamaño las basales que los superiores, opuestas al margen entero, sus flores son de color verdoso y dan lugar a un fruto pequeño (18). Usos Las hojas y los tallos son ricas en alcaloides, taninos, resinas, miristicina y bisabolol, por esto son usadas en diversas preparaciones como infusiones, zumos, chichas (18). 11

21 d) Micosis La dermatofitosis es una infección de la piel, el pelo o las uñas causadas por un grupo de hongos queratofilos denominados dermatofitos. Los dermatofitos y especies de Cándida son los únicos que se transmiten en forma común de un ser humano a otro. Las micosis son las enfermedades producidas por hongos. Existen muchos tipos de hongos pero no todos afectan al ser humano. Si bien existen micosis superficiales y profundas, las que se ven frecuentemente en la consulta diaria son las primeras, que comprometen las capas superficiales de la piel (2,19). e) Efecto antimicótico: Engloba cualquier sustancia capaz de producir una alteración tal de las estructuras de una célula fúngica que consiga inhibir su desarrollo, alterando su viabilidad o capacidad de supervivencia directa o indirecta, lo que facilita el funcionamiento de los sistemas de defensa del huésped (20). f) Descripción del microorganismo Candida albicans Taxonomía: Reino: Fungi División: Deuteromycota Clase: Blastomycetes 12

22 Familia: Cryptococaceae Género: Candida Especie: Candida albicans Generalidades: La Cándida albicans se presenta como una levadura en gemación, Gram positiva, que forma largas seudohifas, hifas y blastoconidios, además son capaces de asimilar y fermentar azucares. Posee numerosas clamidosporas unicelulares, redondas u ovaladas con gruesa pared refrigerante. Cándida albicans es un hongo dimórfico, es decir, se desarrolla de forma distinta en función de la temperatura de crecimiento, como levadura, normalmente a 37ºC en el huésped, y como hongo de aspecto filamentoso, a 25ºC en la naturaleza. Pertenece al filo Ascomycota y se reproduce de forma asexual por gemación. En forma de levadura presenta un aspecto de células redondas u ovaladas, de 3-8 x 2-7 micras de tamaño, agrupadas en pequeños grupos, mientras que, en forma de hongo filamentoso, las células se alargan y se diversifican tomando la apariencia de filamentos, pseudo-hifas o pseudo-micelio (2,20). Patogenia: Este hongo puede asumir patogeneidad provocando la candidiasis; en este caso se presente como una infección vaginal (vaginitis) (2,20). 13

23 Método de hidrodestilación: El método de hidrodestilación; se basa en la destilación de algunas de las partes de las plantas por medio de vapor de agua, este arrastra el aceite esencial que contiene las partes de la planta (flores, frutos, hojas y tallos) (21,22). 14

24 III. HIPÓTESIS a) Hipótesis alternativa (H1): Las diferentes concentraciones del aceite de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona difieren en su efecto antimicótico in vitro en Candida albicans cepa ATCC b) Hipótesis nula (H0): Las diferentes concentraciones del aceite de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona, no difieren en su efecto antimicótico in vitro en Candida albicans cepa ATCC

25 IV. METODOLOGÍA 4.1 Diseño de la investigación La investigación es de diseño experimental con estimulo creciente y grupo control. En el control negativo se utilizó Dimetilsulfóxido (DMSO), que se empleó para la disolución del aceite esencial de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona, y comprobar si presenta efecto antimicótico. En el control positivo se preparó una concentración de fluconazol al 3.2% diluido en dimetilsulfóxido. Grupo experimental consistió en cuatro concentraciones de 5%, 10% 20% y100%; cada concentración se trabajó con cuatro placas, cada placa se dividió en cuatro cuadrantes, cada cuadrante se le hizo un hoyo, para poder agregar el aceite esencial. Tipo de investigación. De acuerdo al fin que se persigue la investigación es básico y en cuanto al enfoque es cuantitativo. Nivel. El nivel de la presente investigación es explicativo. 16

26 4.2. Población y muestra Población vegetal: En este estudio, se consideró como población a la familia de las Piperáceas, del género Peperomia, plantas herbáceas, de donde se había extraído el aceite esencial de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona a diferentes concentraciones 5%, 10%, 20% y 100%, esta planta se obtuvo de la Provincia de Otuzco a 3,018 msnm, Departamento La Libertad. En la cual se determinó la acción bilógica que se trabajó con muestras de Candida albicans cepa ATCC Procedente de la facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo. Muestra vegetal: La muestra está conformada por la especie Peperomia inaequalifolia, conocida comúnmente como congona, de la cual se utilizaron 5 Kg de sus hojas de dicha planta; se extrajo su aceite esencial y se ensayó en cuatro diferentes concentraciones sobre cultivo de Candida albicans cepa ATCC para determinar el efecto de la actividad antimicótica del aceite esencial. 17

27 Criterios de inclusión: a. Plantas frescas. b. Plantas pobladas de hojas. c. Plantas con hojas grandes Criterios de exclusión: a. Plantas en mal estado, que estén secas, con hojas pequeñas y pocas pobladas de hojas. Población microbiológica: La población microbiológica lo conforman el microorganismo Candida albicans cepa ATCC Muestra microbiológica: Estuvo conformada por el microorganismo de Candida albicans cepa ATCC concentrada, se ajusta a una densidad óptica 0.5 McFarland. Criterios de inclusión: a. Se empleó levaduras jóvenes incubadas durante 24 horas. Criterios de exclusión. a. Cepas que sobre pasen las 24 horas de haberse cultivado. 18

28 4.3. Definición y Operacionalización de las variables. Variables Definición Definición Indicador Tipo de conceptual operacional medición Independiente Son la fracciones Se utilizó el aceite 5%, Cualitativa Aceite de las líquidas volátiles, esencial en 4 10%, nominal hojas de generalmente concentraciones 20%, Peperomia destilables por diferentes, para los 100%. inaequalifolia arrastre con tratamientos. congona vapor de agua, Dependiente sustancia capaz Se evaluó mediante la Cuantitativa Efecto de producir una medición del halo de mm de razón. antimicótico alteración tal de inhibición en cultivo sobre Candida las estructuras de sobre Candida albicans cepa una célula albicans cepa ATCC fúngica que ATC10231 consiga inhibir su desarrollo 19

29 4.4 Técnicas e instrumento La técnica empleada en la investigación fue la observación y como instrumento se utilizó una ficha de recolección de datos en la que se registró. Procedimiento: 1. El material vegetal congona Peperomia inaequalifolia, se conservó en temperatura ambiente sin exponerse a los rayos solares para mantener las hojas verdes. 2. Separar las hojas de los tallos y pesar para la extracción 5 Kg. Destilación del aceite esencial de las hojas por el método de Hidrodestilación. A. Extracción del aceite esencial: Para la extracción se utilizó el equipo de destilación simple que está conformada por: una olla a presión en donde se colocó la muestra vegetal, el refrigerante, una pera de decantación y frasco ámbar para su almacenamiento. 1. Las hojas se colocaron en la olla de presión. Se conectó con el refrigerante y al final quien recibió el producto fue la pera de decantación. 2. Se tuvo mucho cuidado para que no se derrame el agua de la pera de decantación, sabiendo que el aceite estaba en la parte de abajo. 3. Se separó el aceite en un frasco ámbar para su conservación. 20

30 B. Preparación del cultivo: 1. Obtención de la cepa. Se adquirió Candida albicans cepa ATCC 10231, proporcionada por el ceparo de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo. 2. Para la preparación del medio de cultivo; se utilizó agar dextrosa sabouraud, el cual es un medio de cultivo que por sus características, tiene la función de un medio de enriquecimiento para hongos. Se inocularon las placas con agar dextrosa sabouraud con Candida albicans haciendo uso de 65 g de agar dextrosa sabouraud, diluida en un litro de agua destilada y se incubó a 35 C ± 1 C, se utilizó cultivos de 24 horas en Candida albicans para la utilización de los extractos. Se utilizó la Escala de McFarland para observar la turbidez del microorganismo (Candida albicans). 1. Esterilización de los tubos de ensayo con su tapón respectivo en autoclave. 2. Se tomó una muestra de Candida albicans cepa ATCC y se sumergido en el tubo de ensayo con solución salina totalmente desinfectado y tapado. 3. Se agito un promedio de 3 minutos, alcanzando una turbidez equivalente al tubo N 3 de escala de McFarland (23). 21

31 C. Preparación de las placas: Se colocó en la placa el medio agar sabouraud de 17 a 20 ml, se dejó solidificar por los menos 30 minutos, luego se dividió en cuatro cuadrantes y en cada cuadrante se le hizo un hoyo. Se preparó la solución de Candida con solución salina fisiológica. Previa esterilización para evitar la contaminación, luego se procedió al sustrato con Hisopo. El método de siembra Siembra en superficie D. Incorporación del aceite esencial al medio de cultivo: Se inició diluyendo el aceite esencial de Peperomia inaequalifolia congona con el diluyente dimetilsulfóxido (DMSO), para obtener las concentraciones de 5%, 10%, 20% y 100%. 1. Para la concentración al 5%, se agregó 0.05 ul de aceite esencial de Peperomia inaequalifolia congona y 0.95 ul de dimetilsulfóxido (DMSO). 2. Para la concentración del 10%, se agregó 0.1 ul de aceite esencial Peperomia inaequalifolia congona y 0.9 ul de dimetilsulfóxido (DMSO). 3. Para la concentración del 20%, se agregó 0.2 ul de aceite esencial Peperomia inaequalifolia congona y 0.8 ul de dimetilsulfóxido (DMSO). 22

32 4. Para la concentración del 100%, se agregó 1 ul de aceite esencial sin el diluyente, dimetilsulfóxido (DMSO). Una vez preparado el medio cultivo de Candida albicans cepa ATCC 10231, se procede hacer la siembra en placas Petri de agar dextrosa sabouraud, fueron un total de 16 placas (4 placas por cada concentración), las cuales se dividieron en cuatro cuadrantes, en cada cuadrante se hizo un hoyo, y con ayuda de una micro pipeta se aplicó el aceite esencial de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona ; en cada cuadrante a diferentes concentraciones. Luego las placas fueron llevadas a la incubadora por 24 horas a 30 C. Para luego proceder a la lectura de cada placa. E. Lectura de las placas: Los halos de inhibición de las diferentes concentraciones, se utilizó una regla milimétrica (mm); los cuales fueron procesados estadísticamente Plan de procesamiento y análisis Los datos de los diámetros de inhibición fueron transcritos a una base de datos y procesados de manera automatizada con el soporte del paquete estadístico SPSS-22, para luego presentar los resultados en tablas estadísticas de acuerdo a los objetivos planteados. En la Estadística inferencial se realizó el uso del análisis de varianza para comparar los niveles medios, considerando que existe diferencia en al menos el promedio de los grupos de estudio, si la probabilidad de 23

33 equivocarse es menor al 5%(p<0.05).Para comparar los efectos medios por parejas de tratamientos se hizo uso de la prueba post anova de Duncan con el mismo criterio de significación y que podrá identificar la concentración con mayor efecto. Para evaluar de manera más objetiva los resultados también se reportarán con el gráfico más relevante. 24

34 4.6 Matriz de consistencia Título de Investigación Formulación del problema Objetivos Hipótesis Tipo de Investigación Diseño Variables Definición operacional Indicadores y escala de medición Plan de análisis Efecto antimicótico in vitro de diferentes concentraciones del aceite esencial de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona en cultivo de candida albicans cepa ATCC Tendrán el mismo efecto antimicótico in vitro las concentraciones del aceite esencial de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona, en el cultivo cepas de Candida albicans ATCC 10231? Objetivo general. Determinar el diámetro de los halos de inhibición como efecto antimicótico in vitro del aceite esencial de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona en cultivo de Candida albicans cepa ATCC 10231según concentraciones. Hipótesis alternativa Las diferentes concentraciones del aceite de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona difieren en su efecto antimicótico in vitro en Candida albicans Hipótesis nula Las diferentes concentraciones del aceite de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona, no difieren en su efecto antimicótico in vitro en Candida albicans Tipo de investigación Cuantitativo Diseño investigación Experimental Independiente: Aceite de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona Dependiente: Efecto antimicótico sobre Candida albicans cepa ATCC Se utilizó el aceite esencial en 4 concentracio nes diferentes, para los tratamientos. Se evaluó mediante la medición del halo de inhibición en cultivo sobre Candida albicans cepa ATC %, 10%, 20%, 100%. Cualitativa nominal mm Cuantitativa de razón. Prueba estadística Kruskal- Wallis Mann- Whitney 25

35 4.7. Principios éticos Los aceites esenciales deben contar con exigencias para asegurar la calidad, inocuidad y eficacia; utilizando los indumentaria adecuada, teniendo en cuenta el tipo de extracción. 26

36 V. RESULTADOS 5.1 RESULTADOS Tabla N 1 DIÁMETRO DEL HALO DE INHIBICIÓN COMO EFECTO ANTIMICÓTICO IN VITRO DEL ACEITE ESENCIAL DE LAS HOJAS DE Peperomia inaequalifolia CONGONA EN CULTIVO DE Candida albicans cepa ATCC 10231, SEGÚN CONCENTRACIÓN. diámetro del halo(mm) Concentración del aceite esencial Peperomia inaequalifolia Control negativo 5% 10% 20% 100% Control positivo - Media Desviación estándar Prueba K-W+ K-W =89.84 p=0.000 p < 0.01 Kruskal Wallis: Prueba no paramétrica 27

37 Tabla N 2 COMPARACIÓN DEL EFECTO ANTIMICÓTICO IN VITRO EN DIFERENTES CONCENTRACIONES DEL ACEITE ESENCIAL DE LAS HOJAS DE Peperomia inaequalifolia CONGONA EN CULTIVO DE Candida albicans cepa ATCC Concentraciones del aceite esencial Peperomia inaequalifolia OBSERAVCIÓN Control negativo 5% 10% 20% 100% Control positivo Halos de inhibición 0.75± ± ± ± ± ±0.91 Promedio Comparación De halos A A A A B B p<0.05 para B vs A Prueba de Mann-Whitney con ajuste de bonferroni Parejas de grupos con letras iguales no difieren estadísticamente. 28

38 5.2 ANÁLISIS DE RESULTADOS En la presente investigación se buscó determinar si el aceite de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona a diferentes concentraciones tiene efecto inhibitorio sobre el cultivo de Candida albicans, se demostró al apreciarse que en diversas concentraciones existen una inhibición del desarrollo antimicótico, según los resultados obtenidos. En esta tabla 1, se aprecia el diámetro medio del halo de inhibición según concentración del aceite esencial de Peperomia inaequalifolia congona, pudiéndose distinguir que el diámetro aumenta a medida que aumenta la concentración. Se observa que la concentración al 100% alcanza un valor que se puede considerar sensible para la levadura, pero aún menor que el control positivo. Se comparan los promedios con la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis (La prueba F del análisis de varianza no es recomendable en este caso por la falta de cumplimiento de homogeneidad de varianzas). La prueba de Kruskal- Wallis indica una diferencia estadística altamente significativa (p<0.01), lo que permite señalar que al menos una de las concentraciones tiene un efecto medio significativo en comparación a los demás y este caso corresponde al aceite esencial al 100%. Por lo que se rechaza H0 y se acepta H1, lo que se significa que los valores obtenidos de la concentración al 100% si presentan actividad antimicótica, esto coincide con el estudio realizado por Carvajal y Quintero, demostrando que Candida albicans es sumamente sensible al aceite esencial de Peperomia inaequalifolia congona, a esta concentración (10). 29

39 En la tabla 2, se observa las comparaciones de los halos de inhibición a diferentes concentraciones a través de la prueba Mann-Whitney, se observa que no difieren entre si dicha acción antimicótica; entre las concentraciones de 5%, 10% y 20% (p>0.05), siendo bajos sus valores de diámetros de halo de inhibición, por lo que dicho efecto no es importante. Sin embargo a la concentración de 100% difiere su acción antimicótica significativamente con respecto las anteriores concentraciones (p<0.05). Según esta misma prueba estadística no se encuentran diferencia significativa en la actividad antimicótica entre la concentración del aceite esencial Peperomia inaequalifolia congona al 100% y el control positivo, en este caso el antimicótico Fluconazol. Muy importante la concentración al 100% respecto al grupo del control positivo puede tener un efecto medio similar, algo menor, con un efecto antimicótico estadísticamente no diferenciado (p>0.05). Según estudio de Carvajal y Quinteros, identificaron 10 compuestos que posee el aceite esencial de Peperomia inaequalifolia congona, siendo los más abundantes Miristicina %, Elimicina % y Bisabolol alpha 6.64% son los tres compuestos que presentan mayor porcentaje; mientras que otro estudio de Coronel y Piedra, identificaron presencia de Safrol 3.19%, Palmitato de isopropilo 2.54%, Miristicina 0.19% y Triazol 1.68% (10,11). En el primer estudio no especifican con claridad cuál de los tres componentes tiene actividad antimicótica; y en el estudio realizado por Coronel y Piedra al 30

40 identificar el compuesto triazol en el aceite esencial de Peperomia inaequalifolia congona, permite investigar acera de este componente. Y según el estudio de Thomson y Tapia, manifiesta que el triazol pertenece al grupo de triazoles que tienen como mecanismo de acción actuar en ciertas etapas de síntesis del ergosterol; bloqueando la 14 alfa lanosterol desmetilasa, la disminución del ergosterol causan una alteración de la membrana celular, que se vuelven más permeable y vulnerable al daño. (24,25). 31

41 VI. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 6.2 CONCLUSIONES 1. Se logró comparar el efecto antimicótico que posee el aceite esencial de las hojas de Peperomia inaequalifolia congona a diferentes concentraciones. 2. Se logró determinar que el aceite esencia de Peperomia inaequalifolia congona, a medida que aumenta las concentraciones, aumenta el efecto antimicótico. 3. Se logró comparar que la concentración al 100% difiere su actividad antimicótica con respecto a las concentraciones del 5%, 10% y 20% RECOMENDACIONES 1. Seguir promoviendo la investigación en cuanto a los estudios de las plantas medicinales y sus principios activos para evaluar sus efectos farmacológicos. 2. Seguir realizando más investigaciones sobre las concentraciones del aceite esencial de Peperomia inaequalifolia congona para determinar a qué concentración tiene efectos terapéutico sobre la Candida albicans. 32

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47 ANEXOS Figura N 1: Planta de congona Figura N 2: Ciudad de Otuzco 38

48 Figura N 3: Obtención del material vegetal Peperomia inaequalifolia congona Figura N 4: Separación de las hojas de los tallos de la planta de Peperomia inaequalifolia congona Figura N 5: Hojas de la planta de Peperomia inaequalifolia congona Figura N 6: Pesar las hojas de Peperomia inaequalifolia congona Figura N 7: Preparación del equipo. Figura N 8: Obtención del aceite esencial 5 ml 39

49 Figura N 9: Aceite esencial de Peperomia inaequalifolia (5 ml) Figura N 10: Siembra del microorganismo en agar sabouraud. Figura N 11: Aplicación de diferentes concentraciones del aceite esencial en el microorganismo Figura N 12. Lectura al microorganismo 40

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